Российская методика определения микробной трансглутаминазы (мТГ) в продуктах питания прошла аттестацию

Компания «ХЕМА», российский производитель реагентов для научных исследований в различных областях, аттестовала разработанную методику измерений массовой доли микробной трансглутаминазы (мТГ) в пробах продуктов питания методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью набора реагентов «МТГ-ИФА» собственного производства. В данной тест-системе используется принцип двухсайтового (сэндвич) иммуноферментного анализа.

По сообщению заместителя генерального директора по развитию ООО «Хема» Павла Петухова, методика аттестована 11 февраля 2019 года, и уже подана в Федеральный информационный фонд по обеспечению единства измерения Росстандарта. В этот же день информационное письмо было разослано по контрольным службам Роспотребнадзора и Россельхознадзора.

Как работает тест-система?

В последнее время в связи с возрастающими требованиями общества к качеству пищевых продуктов, и, в частности, к их органолептическим показателям, перед предприятиями встает задача производства продуктов с улучшенными характеристиками. Такое положение наблюдается, в частности, в молочной и мясной промышленности, где уделяется особенное внимание не только характеристикам, но и текстуре продукта. Однако в связи с высокой стоимостью исходного сырья в целях удешевления готовой продукции производители часто прибегают к использованию различных текстураторов, например, ферментам-модификаторам сырья. Одним из таких ферментов, получившим широкое распространение, является микробная трансглутаминаза (мТГ).

мТГ (протеин-глутамин-γ-глутамилтрансфераза, (КФ 2.3.2.13) – распространённый в живой природе фермент, участвующий в жизненно важных биологических функциях. ТГ катализирует реакции ацильного переноса между γ-карбоксиамидной группой пептид-связанных остатков глутамина (ацильный донор) и различными первичными аминами, в том числе ε-аминогруппой остатков лизина (ацил-акцептор), что приводит к формированию «сшивок» в молекулах белка. Это сшивание может быть как внутри-, так и межмолекулярным, что в последнем случае приводит к упрочнению белкового каркаса. Получаемые в промышленных масштабах препараты мТГ применяют в технологиях переработки молока, мяса и других видов пищевого сырья. Имеются сведения об использовании препаратов мТГ в технологии производства пищевых плёнок.

Тест-система, предложенная компанией «ХЕМА», предназначена для качественного выявления содержания мТГ в пищевых продуктах.

Подробнее о принципе определения. В лунки микропланшета с сорбированными на их поверхности моноклональными мышиными антителами против мТГ, вносят исследуемый образец. Антиген из образца связывается с антителами на поверхности лунки. Несвязавшийся материал удаляется отмывкой. В лунки вносят вторые антитела к этому же антигену, меченые пероксидазой хрена. После повторной отмывки активность фермента, связанного с поверхностью лунки микропланшета, проявляется и измеряется добавлением хромоген-субстратной смеси, стоп-раствора и фотометрией при 450 нм. Интенсивность цветной реакции прямо пропорциональна количеству антигена в образце.

Набор рассчитан на 96 определений и обеспечивает анализ 45 образцов в дублях.

Минимальная достоверно определяемая данным набором концентрация антигена мТГ в пробе не превышает 0.001 Ед/мл. Это примерно соответствует:

- 10 ppm чистой рекомбинантной мТГ (Zedira, #T113), разведенного в буфере для ИФА;

- 0.01% промышленного препарата мТГ.

Специфичность данного набора определяется специфичностью использованных моноклональных антител против антигена-мишени. На содержание антигена-мишени не влияют технологические процессы, которым подвергается сырье, а также тип продукта (кисломолочные изделия, мясные полуфабрикаты и пр.). Наличие антигена связано только с присутствием его в начальном сырье.

Подчеркнем, что в технический регламент Таможенного Союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) данный фермент не внесен и его использование до внесения в регламент не законно.

«ХЕМА» – единственная в СНГ компания, которая использует реагенты собственного производства в большинстве выпускаемых ИФА наборов. Данное преимущество позволяет не только расширять ассортимент продукции и быть максимально независимыми от внешних условий, но и поставлять компоненты другим производителям ИФА наборов, как в СНГ, так и за его пределы.

Реагенты «ХЕМА» применяются по всему миру в производстве быстрых тестов и для научных исследований. Производство реагентов включает в себя виварии в России и Украине, а также биохимические лаборатории по выделению антигенов и антител в Москве и Санкт-Петербурге. Все реагенты проходят тщательный контроль качества – чистота, активность, специфичность и т.п. процедуры, о чем свидетельствует приложенный к каждому лоту компонента паспорт. Качество производимой продукции подтверждено многочисленными научными публикациями, что позволяет успешно продавать реагенты не только в России, но и по всему миру.

На острие ножа

Учитывая остроту темы и предвидя бурную дискуссию, которую вызовет эта статья, мы собрали вопросы и замечания, волнующие наших читателей, и попросили Павла Петухова на них ответить.

Вопрос №1. Грош цена такому тесту – он будет определять и тканевую ТГ в колбасе.

– Антитела «заточены» именно под микробиальную ТГ. В исследовании данной методики мы использовали стандарты международного образца. В том числе, стандарт к тканевой ТГ на всех матрицах и чистых растворах не давал перекрестной активности к микробиальной ТГ.

Вопрос №2. Сколько можно класть трансглютаминазы, чтобы методика не поймала концентрацию? Каков порог референсных значений?

– Наш предел выявления с помощью набора реагентов «МТГ-ИФА» производства ООО «ХЕМА» в диапазоне содержаний мТГ от 0,0001 % до 0,01%. Еще раз отмечу, пока ее нет в ТР ТС 029/2012, ее нельзя добавлять.

Сарделька ГОСТ известного производителя, в который был обнаружен фермент.

Вопрос №3. Скоро ее внесут в ТР ТС? Какой будет ПДК?

– Внесение в технический регламент Таможенного Союза – это долгий процесс, который занимает от года до двух лет, но если методика актуальна, ее можно использовать в лабораториях надзорных органов при условии, что они введут ее в область аккредитации и проведут валидацию.

Вопрос №4. Роспотребнадзор будет проверять на количество или на качество?

– Пока выявление мТГ будет по уровню чувствительности тест системы, то есть качественным, отмечающим наличие или отсутствие трансглутаминазы в исследуемом образце.

Вопрос №5. Может ли лаборатория определять активность фермента? Если нельзя определить активность в порошке, то в продукте – тем более. Для начала пусть специалисты «ХЕМА» докажут, что они вообще могут измерять активность фермента.

– На данный момент нет задачи проверять продукты по позиции активная это добавка или нет. Ее в любом виде пока не должно быть в продуктах питания. Когда появится необходимость проверять инактивацию фермента в продукте, мы обязательно озаботимся этим вопросом.

Вопрос №6. Как скоро начнут проверять?

– Это вопрос не ко мне, а к надзорным органам.

Вопрос №7. Можете ли вы дать определение слова «иммуноферментный»? Откуда в колбасе иммунитет?

– Слово «иммуноферментный» в данном случае относится не к продукту, а именно к специфике анализа. Это слово означает высокоспецифичное взаимодействие двух белков, в данном случае антигена мТГ в исследуемом продукте и антитела к ней в нашем наборе.

Вопрос №8. Какое оборудование мне нужно купить на завод, чтобы проверять входящие порошки на фермент?

– На данный момент стартовый набор ИФА лаборатории включает: планшетный спектрофотометр (ИФА-ридер), набор дозаторов, термостат, центрифугу. Но в скором времени мы представим его в формате экспресс-теста, для проведения которого не потребуется никакого дополнительного оборудования.

Вопрос №9. Как мне удостовериться, что ваша методика работает, что она одобрена, что это не ошибочный метод?

– Во-первых, компания давно зарекомендовала себя на рынке в качестве надежного производителя ИФА-наборов. Во-вторых, каждый год мы проходим сертификацию по ISO 9001 и 13485; эту методику аттестовал международно-признанный метрологический институт УНИИМ. В-третьих, мы использовали стандарты с чистотой 95% и 99,5%. Также в будущем в доказательство работы методики будут проведены международные сличительные испытания.

Вопрос №10. Вопрос от разработчиков комплексных добавок. Данный метод ИФА определяет именно сам активный фермент-белок, или, возможно, также реагирует на его уже инактивированную форму? В статье Владимира Романова «Трансглютаминазация России. 13-й фактор» один из спикеров говорил следующее: «Даже если бы температура термообработки не поднималась выше, фермент необратимо потеряет активность ввиду полной выработки субстрата. В случае 60°С и выше происходит температурная денатурация, фермент перестает быть ферментом, так как теряет способность катализировать сшивку белков и, имея белковую природу, становится обычным белком.».

Но, возможно, он, как и все мы, заблуждался?

– Наши антитела выявляют антиген белкового строения! То есть, нам абсолютно не важно, сохраняет ли белок активность (т.е. является ферментом) или же теряет ее. Однако, могу поделиться нашими экспериментальными данными: при обработке промышленной мТГ в автоклаве при 40 минутах сигнал полностью исчезает. Это означает полную денатурацию белка и антитела набора не видят его.

Вопрос №11. Вопрос от Владимира Романова, портал «Мясной Эксперт». Прокомментируйте выводы статьи «Трансглутаминаза при дисбактериозе как потенциальные факторы аутоиммунной реакции», где авторы Aaron Lerner, Rustam Aminov и Torsten Matthias ссылаются на ряд свежих исследований с выводами о неблагоприятном воздействии mTG при попадании в кишечник человека. Стоит отметить, что  другой исследователь  (Bueno et al., 2016) сообщает: «Недавно было заявлено, что микробные ферменты абсолютно безопасны для здоровья. Кроме того, ферменты не остаются активными в конечных продуктах.

Тем временем, несколько наблюдений (Лернера и Матиаса) оспаривают это заявление, что было резюмировано Буэно М.М. в 2016 году. Если будущие исследования подтвердят данную гипотезу, это повлияет на маркировку продуктов питания, политику в отношении пищевых добавок в пищевой промышленности и просвещение потребителей по вопросам здоровья».

– Со статьей в чем-то могу согласиться, а в чем-то возразить. Но самое главное, при внесении в ТР ТС данного фермента я хочу видеть документ, подписанный специалистами по питанию, которые со 100% уверенностью признают фермент безопасным и определят, какое его количество будет являться нормой.

Мы все равно сможем определить белок фермента в том количестве, которое туда положили (активный или инактивированный). Но количество внесенного фермента можно контролировать, исходя из нормы, которую пропишут российские НИИ питания и пищевой промышленности.

Картины Васи Ложкина в переговорной компании «ХЕМА»

Во время работы над статьей мы еще раз собрались в R&D «Хема», где присутствовали представители известных мясоперерабатывающих заводов, аккредитованных лабораторий, разработчики функциональных добавок для пищевой промышленности, и, разумеется, я. Гости лаборатории привезли закодированные образцы с мТГ, как в виде сыпучих комплексных добавок, так и в виде готовой продукции – колбасы. ИФА-анализ определил качественно нахождение мТГ. Все присутствующие потвердели правильность определения сотрудниками «Хема» образцов, включающих трансглютаминазу, через разработанную методику и реактивы. Для некоторых представителей с производства нахождение мТГ в готовой продукуии и в сыпучих ингредиентах стало неприятной новостью.

Образцы с мТГ в дублях. После добавления стоп-раствора, по желтому можно уже даже визуально можно определить образцы где присутствует ТГ без ридера.